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布魯氏桿菌病虎紅平板凝集試驗操作及注意事項！布氏桿菌病是一種由布魯氏菌引起的人獸共患動物源性*性傳染病，它是世界動物衛生組織（OIE）規定的B類動物疫病，我國也將其列為二類動物疫病之首。該病不僅阻礙我國畜牧業的發展，同時對人體健康產生重大影響，21世紀由于畜間布病的影響，我國人間布病的發病率有所提高，國家適時出臺了《畜間布魯氏菌病防控五年行動方案（2022—2026年）》，確定了到2026年，我國牧場個體陽性率控制在0.4%以下，群體陽性率控制在7%以下的總體目標。為達成目標離不開檢測技術的支持，現階段布病的檢測方法較多：如虎紅平板凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT）、補體結合試驗（CFT）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。但虎紅平板凝集試驗（RBPT）還是應用最廣泛的檢測手段。
一、布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗 （RBPT）的優勢及原理 1、當前布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗（以下簡稱虎紅平板凝集試驗）仍然是我國布病診斷使用頻率*、最主要的檢測方法，是我國法定的檢測方法，在國際貿易中也是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測的指定試驗，該檢測方法具有試驗試劑成本低廉、操作簡便、快速、檢出率高等優勢，被廣泛應用于布病的大規模篩查、引種、及疫苗免疫效果評價等。由于本方法不需要特殊的試驗設備，更適于基層實驗室和現場試驗，經簡單培訓后，養殖戶也可自行完成檢測。為布病的防控及凈化提供了強有力的檢測手段。 2、虎紅平板凝集試驗又稱為班氏孟加拉紅平板凝集試驗。由于所用的抗原是酸性(PH3.6-3.7)帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時能抑制血清中的lgM類抗體的凝集活性、檢查的抗體是lgG類，因此提高了反應的特異性。 二、試驗材料準備 1、由賽諾利康生物技術（北京）有限公司生產的虎紅平板凝集抗原、標準陽性血清、陰性血清。陰性和陽性血清為凍干品，使用時按標明的毫升數用0.5%苯酚（俗稱石炭酸）生理鹽水進行稀釋備用。 2、采血應規范、自然出清、且勿添加抗凝血劑，被檢血清應新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。 3、潔凈玻璃板，其上劃分成4c㎡小格并做好與家畜相應的標號或者使用凝集試驗板。 4、吸管或移液器，適于滴加30μL（0.03mL）液體。移液器的規格*為5-50μL，確保劑量的準確。 5、準備牙簽供攪拌用，確保每個樣本都使用單獨牙簽。 6、稱取0.5克苯酚（俗稱石炭酸），加入100ml的生理鹽水中，配置后高壓鍋中121℃高壓30分鐘。 三、操作方法 1、實驗前，應將抗原在室溫放置30-60min。 2、將玻璃板上各方格標記被檢血清號，然后加相應被檢血清30μL（0.03mL）。 3、在被檢血清旁滴加虎紅平板凝集抗原30μL（0.03mL）。 4、用牙簽類小棒攪動血清和抗原，使之充分混合，在4分鐘內觀察結果，確保每個樣本血清使用單獨的牙簽。 5、每次試驗應設陰性血清、陽性血清對照。 四、結果判定 1、在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。 2、受檢血清在4min內出現肉眼可見凝集現象者判為陽性(+)，無凝集現象，呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。一定注意超過4min沒有判定意義。 3、在觀察時可將玻璃板或凝集板進行搖動使混合液流動，更利于結果的觀察。 4、如下圖1號為陰性，2號為陽性。如家畜未接種布病疫苗，則陽性者為感染布氏桿菌病。
五、注意事項 1、血清的質量是影響布病血清學試驗結果準確性的重要因素之一，血清*是新鮮、清亮透明、無溶血、防止*污染，并且避免反復凍融。為使檢測結果準確*使血液自然出清，自然出清優于使用離心機。可減少纖維蛋白原與虎紅抗原產生非特異性凝集反應。 2、抗原在室溫放置30min-60min進行回溫，利于抗原與抗體的結合。 3、在早晨喂料前或停食后6小時進行采血，空腹血清出現假陽性少。采集血液樣本時不要加抗凝劑，以免影響對檢測結果做出正確的判定。 4、本試驗溫度在室溫22±4℃進行結果更加準確，一定溫度范圍內，溫度越高，血清學反應進行的越快。因此，在試驗前要注意環境溫度是否適合進行本試驗。 5、凡是試驗中凝集顆粒不規則，大小不勻，片狀或絮狀，凝集不清澈者，一般為假陽性，否則凝集顆粒規則大小均勻，凝集清澈者為陽性。 6、抗原的質量是影響布病血清學試驗結果準確性的關鍵性因素之一，一定要采購正規廠家、產品穩定、經國家認可的產品。運輸過程中要2-8℃冷鏈運輸，以確保產品質量。 7、對于未操作過該試驗的人員，每次進行檢測的樣本數量不宜超過5個，并且抗原*統一加到血清旁，最后分別用牙簽進行混勻。 |
